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胰脂肪酶靶點占有率模型建立-貝爾QL-866使用

返回列表 來源:未知 發(fā)布日期:2019-12-30 10:12【

胰脂肪酶是一種由動物或人類胰腺分泌的水 溶性脂肪分解酶,在甘油三酯的消化中發(fā)揮著重要胰脂肪酶是一種由動物或人類胰腺分泌的水 溶性脂肪分解酶,在甘油三酯的消化中發(fā)揮著重要發(fā)生率的逐年上升,藥物治療成為治療肥胖癥的有 效手段之一。


1 材料與方法 


1.1 儀器與軟件 


TU-1810紫外可見分光光 度 計(北 京 普 析 通 用 儀 器 有 限 責 任 公 司);MultiSkan FC酶標儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司];QL-866渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);DZKW-4電熱恒溫水浴鍋(北 京 中 興 偉 業(yè) 儀器有限 公 司);FAI604萬 分 之 一 天 平(上 海 天 平 儀器廠);JA5003B千分之一天平(上海越平儀器有 限公司);SiGmA 高速冷凍離心機(北京五洲東方科 技發(fā) 展 有 限 公 司);Brand 移 液 槍 (德 國 Brand 公 司);KQ5200E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限 公司);STARTER2100PH 計(深圳市展華儀器儀 表 有 限 公 司 );GastroplusTM (Version9.5.0004 SimulationsPlusInc.,Lancaster,CA,USA); ADMETPredictorTM軟件(Version8.1.0.0)。 


1.2 試 劑 


豬 胰 脂 肪 酶 (上 海 源 葉 生 物 有 限 公 司);對硝基苯基棕櫚酸酯(P-NPP)(≥98%,阿法埃 莎化學有限公司);脫氧膽酸鈉(純度:>99.0%,上海江萊 生 物 科 技 有 限 公 司);二 甲 基 亞 砜(DMSO) (北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司);磷酸二氫 鈉、異丙醇、高 氯 酸(北 京 化 工 廠)、氫 氧 化 鈉(天 津 市光復科技發(fā)展有限公司)均 為 分 析 純;奧 利 司 他 (純度:≥98%,中山萬漢醫(yī)藥科技有限公司)、新利 司他(純度:≥98%,上海源葉生物科技有限公司); 娃哈哈飲用純凈水(杭州集團娃哈哈有限公司)。 


1.3 方法 


1.3.1 胰脂肪酶溶液的制備 


精密稱定胰脂肪酶 100mg,于 50 mL 離 心 管,加 入 10 mL 冷 的 50 mmol·L-1磷 酸 鹽-5mmol·L-1脫 氧 膽 酸 鈉 緩 沖 液 (pH8.0),3000r·min-1渦旋5min,4 ℃下離心半 徑7.4cm,7000r·min-1離心10min,傾出上清液 至一新的離心管,即得。使用時保存在0~6℃冰水 浴環(huán)境。 


1.3.2 胰脂肪酶抑制劑IC50的測定 


精密稱取奧 利司他、新 利 司 他 各 10 mg 至 于 10 mL 量 瓶 中, DMSO 溶解并 定 容,冷 藏 儲 存,使 用 前 取 出 室 溫 融 化,搖勻后以緩沖液稀釋得系列不同濃度的抑制劑 溶液(奧利司他終濃度0~2880nmol·L-1;新利司 他終濃度0~6144nmol·L-1)。分別?。埃常恚桃? 制劑溶液和上述已制備的酶溶液于試管中,加緩沖 液補至2.7mL,搖勻,37 ℃水浴溫孵15min,加入 1mmol·L-1p-NPP底物溶液0.3mL,37℃水?。保? min后立即于405nm 測定其吸光度,空白以等量不 含抑制劑的 溶 液 代 替,每 組 反 應 平 行3次。IC50計 算采用公式(1),其中 K 為曲線的上限值,a為增長 速度,采用三參數(shù)logistic曲線擬合求解。


2 結(jié)果


胰脂 肪 酶 作 用 于 P-NPP分解出 對 硝 基 苯 酚 (P-NP),該 產(chǎn) 物 在 405 nm 處有吸收峰,濃度 與 吸 光 值 成 正 比。測 定 奧 利 司他、新利司他在不同濃度條件下與酶反應后的 吸光度,從 而 得 出 其 對 胰 脂 肪 酶 的 抑 制 活 性。奧 利司他、新利司他對胰脂肪酶的抑制考察,隨著抑制劑濃度的增大,抑 制 率 快速增大,最 大 抑 制 率 均 近100%。采用 公 式(1) 計算得奧利司他的IC50為19.1nmol·L-1,新利 司 他的IC50為76nmol·L-1。


3 討論 


奧利司他和新利司他作為強效的胃腸道脂肪 酶抑制劑,是目前公認的用于治療肥胖癥的藥 物。 本研究測定得 奧 利 司 他 的IC50為19.1nmol·L-1, 新利司他的IC50為76nmol·L-1,均為納摩爾級抑 制。盡 管IC50對 評 估 藥 物 對酶的潛在抑制作用有較大的價值,但因其只能反 應藥物-靶標結(jié)合的平衡狀態(tài),不能反映整個結(jié)合的 動力學過程,且無法預測藥物對酶抑制的快慢和作 用持續(xù)的時間等,存在較大局限性使其無法與體內(nèi) 的藥效活性建立關聯(lián)。




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